Fils de Jacques Amalric, éditorialiste à Libération, et de Nicole Zand, critique littéraire au Monde, Mathieu Amalric se voit proposer en 1984 par Otar Iosseliani, un ami de la famille, de jouer la comédie dans Les Favoris de la lune. Après ce premier contact avec le cinéma (et une année d’hypokhâgne), le jeune homme, qui ne se destine pas au métier d’acteur, enchaîne les tournages en tant qu’accessoiriste, régisseur ou cantinier. Stagiaire assistant réalisateur sur Au revoir les enfants, il travaille aussi auprès de Joao Cesar Monteiro et Romain Goupil.
En 1996, Mathieu Amalric accède à la notoriété en tant que comédien : remarqué dans Le Journal du séducteur, il incarne Paul Dedalus, le séducteur maladroit et indécis de Comment je me suis disputé… d’Arnaud Desplechin, prestation pour laquelle il décroche le César du Meilleur espoir en 1997. Nouveau chouchou du cinéma d’auteur, il tourne avec Techiné (Alice et Martin), Assayas (Fin août, début septembre) ou Jean-Claude Biette et devient le compagnon de route – et de randonnée – des frères Larrieu (Un homme, un vrai en 2003).
Parallèlement à ses activités d’acteur, Mathieu Amalric s’illustre dans la réalisation, d’abord en 1997 avec Mange ta soupe, long-métrage aux accents autobiographiques qui lui vaut les éloges de Godard. Suivent Le Stade de Wimbledon (2001), promenade poétique et mystérieuse avec Jeanne Balibar (qui fut sa compagne), La Chose publique, présenté à la Quinzaine des Réalisateurs en 2003. Mais c’est en 2010 qu’arrive la consécration avec le très burlesque Tournée, présenté à Cannes en compétition officielle et récompensé par le Prix de la mise en scène, faisant la joie d’Amalric et de sa troupe vedette de stripteaseuses.
Parallèlement à ces nombreuses prestations devant la caméra, Mathieu Amalric réalise La Chambre bleue (2014), adapté du roman de Georges Simenon, ainsi que Barbara (2017), une évocation poétique de la vie de la célèbre chanteuse avec Jeanne Balibar dans le rôle-titre. Tous les deux sont présentés au Festival de Cannes.